TUNEL法检测细胞凋亡经验总结
- 2021-04-22 17:37
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- 细胞实验
用了许多方法检测小鼠的肝脏、脑部、睾丸等组织的细胞凋亡，其中 TUNEL 法做的最多，我购买的试剂盒主要是 roche、 promega 公司，结果大多数成功，偶尔也有失败，下面我把实验中的关键问题与大家共享一下，同时也希望能对初学者有所帮忙。
TUNEL 法的实验原理
基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让 rTDT 和生物标记的 dTUTP 进入细胞内，在 rTDT 的辅助下 dTUTP 与核断裂的 DNA3』-OH 结合，再用 HRP 标记的链霉亲和素与 dTUTP 上的 biotin 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合 3 个 biotin 分子），最后用 DAB、过氧化氢与 SP 上的辣根过氧化物酶 HRP 发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中 TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。（小编碎碎念：掌握原理是做好实验的先决条件，不少人还以为是抗体抗原反应呢）
TUNEL 实验中关键步骤
1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；
2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶 k 的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3. 适当延长 TUNEL 反应液的时间。一般是 37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色。
4.DAB 显色条件的选择。一般 DAB 反应 10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色），不利于辨认棕褐色，我不太喜欢。
5.PBS 的充分清洗。我个人认为，在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。
6. 此外，内源性 POD 的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。
细胞通透的时间选择
1. 蛋白酶 k 的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与 TritonX100 等细胞通透剂。
2. 蛋白酶 K 一般工作液浓度为 20 μg/ml, 但浓缩液可配制 1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶 K 缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºC 保存 1 个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。
3. 蛋白酶 K 反应时间一般为 10-30 min，具体时间长短与切片厚薄有关，4 μm 左右的片子可以用 10 min，但 30 μm 左右的可用 30 min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。
关键试剂操作条件
DAB 显色反应大约需要 10 min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下。
蛋白酶 K 工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。
DNase 1 一般室温，10 min 即可。
如何减弱非特异性染色
若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短 DAB 孵育时间、PBS 充分清洗，注意镜下把握好着色。
其他注意事项
1. 湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。
2. 英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了「对难处理的组织的处理」，意思是用常规方法处理（如蛋白酶 K) 后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。
3. 复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。
4.PBS 用蒸馏水、Na2 HPO4、KH2PO4 配制，现在有卖的，自己加蒸馏水稀释后即可用，很方便，也不贵。
5. 蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。