吖啶橙荧光染色法
吖啶橙荧光染色法
【实验原理】
吖啶橙（ acridine orange ， AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的 DNA 和 RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm ，荧光发射峰为 530nm （ DNA ）、 640 （ RNA ），它与双链 DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（ 502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约 530nm ），核仁和胞质 RNA 发橘红色荧光（ >580nm ）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示 DNA 、 RNA 两种核酸。
【实验用品】
1、 器材
荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。
2、 试剂
（ 1 ） 0.1mol/l pH7.0 PBS 液
A 液： NaH 2 PO 4 · H 2 O 2.76g ，加蒸馏水至 100ml ；
B 液： Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 5.36g ，加蒸馏水至 100ml ；
取 A 液 16.5ml ＋ B 液 33.5ml ＋ NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至 100ml 。
（ 2 ） 1% 吖啶橙原液
取 0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至 100ml （临用时配制 0.01% 吖啶橙染液：将 1% 吖啶橙原液用 pH7.0 PBS 溶液稀释 10 倍）。
3、 材料
口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌 BEL-7402 细胞爬片。
（ 1 ）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。
（ 2 ） 95% 乙醇溶液固定 5min 。
（ 3 ）滴加 0.01% 吖啶橙染液 5min 。
（ 4 ）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。
【结果与观察】
荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含 DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含 RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
【注意事项】
（ 1 ）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。
（ 2 ）每种荧光染料，均有自己的最适 pH ，此时荧光最强。当 pH 改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的 pH 缓冲液中进行。
【实验原理】
吖啶橙（ acridine orange ， AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的 DNA 和 RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为 492nm ，荧光发射峰为 530nm （ DNA ）、 640 （ RNA ），它与双链 DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（ 502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约 530nm ），核仁和胞质 RNA 发橘红色荧光（ >580nm ）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示 DNA 、 RNA 两种核酸。
【实验用品】
1、 器材
荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。
2、 试剂
（ 1 ） 0.1mol/l pH7.0 PBS 液
A 液： NaH 2 PO 4 · H 2 O 2.76g ，加蒸馏水至 100ml ；
B 液： Na 2 HPO 4 · 7H 2 O 5.36g ，加蒸馏水至 100ml ；
取 A 液 16.5ml ＋ B 液 33.5ml ＋ NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至 100ml 。
（ 2 ） 1% 吖啶橙原液
取 0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至 100ml （临用时配制 0.01% 吖啶橙染液：将 1% 吖啶橙原液用 pH7.0 PBS 溶液稀释 10 倍）。
3、 材料
口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌 BEL-7402 细胞爬片。
（ 1 ）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。
（ 2 ） 95% 乙醇溶液固定 5min 。
（ 3 ）滴加 0.01% 吖啶橙染液 5min 。
（ 4 ）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。
【结果与观察】
荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含 DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含 RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
【注意事项】
（ 1 ）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。
（ 2 ）每种荧光染料，均有自己的最适 pH ，此时荧光最强。当 pH 改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的 pH 缓冲液中进行。