引物的设计合成与纯化
引物
引物（primer），又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。类型
存在有自然中生物的DNA复制引物（RNA引物）和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。一般所说引物，指DNA引物，以下简称引物。引物设计
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。
在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
最佳区域
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
长度
引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
GC含量
引物序列的 GC 含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大
Tm值
引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm=4(G+C)+2(A+T)，在 Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearestneighbor method)
3′ 端避开密码子第3位
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
选择T
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
碱基随机分布
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
自身避免互补
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol，∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性[2] ），否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。
5′ 端中间G值应较高3′ 端较低
△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）
5′ 端可以修饰
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。
单链无二级结构
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
自由能
∆G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3’端 ∆G 值较低（绝对值不超过 9），而 5’端和中间 ∆G 值相对较高的引物。引物的 3’端的 ∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。
特异性
引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。
设计要求
做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：●避免重复碱基，尤其是G.
●Tm=58-60度。
●GC=30-80%.
●3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.
●正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。
●PCR扩增产物长度： 引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。
●引物的退火温度要高，一般要在60度以上；
要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。
做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。
关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的全部物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
设计软件
■Oligo 6
Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；
●按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；
● 对环型DNA片段，设计反向PCR引物；
●设计多重PCR引物；
●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；
●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；
●同源序列查找，并根据同源区设计引物；
●增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以"Lock"每个参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等；
● 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。
■Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。
该软件主要由GeneTank 序列编辑，Primer引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等几个主要功能板块组成。
引物合成
引物合成 是通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
引物合成特点
1.引物合成的纯度高。
2.合成的序列长。
3.合成的效果好。
合成过程
第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉.
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
引物纯化方式
1.C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶剂溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。2.OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
3.PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
4.HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。