iTRAQ介绍
iTRAQ:同位素标记相对和绝对定量---蛋白高通量筛选
同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ) 技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。
iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分reporter group，另一端是肽反应部分peptide reactive group，中间部分是平衡部分balance group。
以4标为例，其中：
1）reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117 Da。
2）peptide reactive group：将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。
3）balance group：质量为31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145 Da，即等量异位标签(isobaric tag)，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。
将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列 b 离子和 y 离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。
技术特点
定量精确：每组平行比较多达8个样本，标记效率高达97%，可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差。
高效率样品分离：进行SCX-HPLC分离，实现自动化操作。
高鉴定率：系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白。
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。
仪器性能优良：基于高分辨率（大于105）、高质量精度（小于1ppm）质谱平台，可获得更加准确的结果。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
实验流程
1.不同的蛋白质样品 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8，首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）；
2. 采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合；
3. 使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱；
4. 8 个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个 峰；
5. 对加入标记的肽段进行二级质谱，同时，平衡基团从报告基团上脱落；
6. 二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119 和 121，其强度分别代表 8 个标记的样品的同一个肽段；
7. 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值；
8. 对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。
应用
1）非常高的通量，同时标记8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量；
2）标记完全，标记效率高达97%以上可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差；
3）可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；
4）可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并可设计样本重复，甚至可以进行个体样本的研究；
5）可以研究细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学；
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。
同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ) 技术由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。
iTRAQ 技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，而后进行串联质谱分析，可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。
iTRAQ试剂是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分reporter group，另一端是肽反应部分peptide reactive group，中间部分是平衡部分balance group。
以4标为例，其中：
1）reporter group：质量为114Da、115 Da、116 Da、117 Da。
2）peptide reactive group：将reporter group与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。
3）balance group：质量为31 Da、30 Da、29 Da、28 Da，使得四种iTRAQ试剂分子量均为145 Da，即等量异位标签(isobaric tag)，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。
将蛋白质裂解为肽段，然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的，即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测，分子量完全相同，用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离，产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中，报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂，质量平衡基团丢失，产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团，不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时，多肽内的酰胺键断裂，形成一系列 b 离子和 y 离子，得到离子片段的质量数，通过数据库查询和比较，可以鉴定出相应的蛋白质前体。
技术特点
定量精确：每组平行比较多达8个样本，标记效率高达97%，可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差。
高效率样品分离：进行SCX-HPLC分离，实现自动化操作。
高鉴定率：系统全面地研究组织或细胞中尽可能多的蛋白质，可鉴定多达6000种蛋白。
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。
仪器性能优良：基于高分辨率（大于105）、高质量精度（小于1ppm）质谱平台，可获得更加准确的结果。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
实验流程
1.不同的蛋白质样品 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8，首先分别进行蛋白酶水解（通常为胰蛋白酶Trypsin）；
2. 采用不同的标记对酶解片段进行标记后混合；
3. 使用液体色谱和质谱的联用进行一级质谱；
4. 8 个不同来源的，同一蛋白的同一个标记肽段在一级质谱上表现为一个 峰；
5. 对加入标记的肽段进行二级质谱，同时，平衡基团从报告基团上脱落；
6. 二级质谱后，报告基团在二级质谱低质量区域产生8个报告离子信号：113、114、115、116、117、118、119 和 121，其强度分别代表 8 个标记的样品的同一个肽段；
7. 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值；
8. 对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。
检测仪器
TripleTOFTM5600系统是第一个把广泛定性探索，快速全貌解析，和高分辨率定量结合在一个单一精确质量平台的系统。新一代的TripleTOFTM5600+系统增加了创新的数据采集方法，合规性的软件，兼容离子淌度差分质谱技术，能够完成以前不可能的研究。 在日采集中，它结合了最高的检测灵敏度，高分辨率和至少5倍最佳采集速度，以及稳定的质量准确度。TripleTOFTM5600+系统是快速评估药物代谢稳定性、药物在体内特征和最终代谢产物鉴定的理想平台。在最快采集速度条件下，用高分辨和准确质量质谱数据，完成无与伦比的蛋白质定性鉴定工作。应用
1）非常高的通量，同时标记8个样品，一次实验实现多达8个样品的蛋白质鉴定和定量；
2）标记完全，标记效率高达97%以上可减少样本处理、以及不同组上机造成的实验误差；
3）可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测；
4）可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并可设计样本重复，甚至可以进行个体样本的研究；
5）可以研究细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学；
适用范围广：无物种特异性限制，理论上可用于所有物种。